Dr. Gerhard Beckers, Dr. Christian Hirsch
Mykotoxine sind natürliche Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen und die Aflatoxine ihre giftigsten Vertreter. Da die Substanzen weitgehend hitzestabil sind, werden sie bei der Nahrungsmittelverarbeitung in der Regel nicht zerstört. Für den Nachweis von Mykotoxinen in Nüssen wird die EG-Verordnung 401/2006 zugrunde gelegt. Dort heißt es in Anhang II: „Da die Verteilung von Mykotoxinen im Allgemeinen nicht homogen ist, müssen die Proben besonders sorgfältig aufbereitet und homogenisiert werden.“ Eine genauere Vorgehensweise dafür schlägt die Verordnung jedoch nicht vor.
Um die Mykotoxine hinreichend aus dem Ausgangsmaterial zu extrahieren, muss die Probe zuvor zerkleinert und homogenisiert werden. Da die Grenzwerte für die Mykotoxin-Belastung zwischen 0,025 und 15 µg/kg liegen und ein Pilzbefall meist in Nestern erfolgt, muss eine Stichprobe ausreichend groß sein, um eine Kontamination nachweisen zu können. Dazu wird eine repräsentative Menge von ca. 1 bis 2 kg pro Tonne an gelieferten Nüssen zunächst mit der Retsch-Schneidmühle SM 100 auf eine Partikelgröße von ca. 1 bis 3 mm vorzerkleinert. Diese Mühle wird vor allem für die schnelle und schonende Zerkleinerung trockener Materialien bis zu einer Endfeinheit von 0,25 mm eingesetzt. Anschließend erfolgt eine repräsentative Probenteilung mit dem Rotationsprobenteiler PT 100, der über eine extrem hohe Teilgenauigkeit verfügt. Die gewonnene Teilprobe wird nun der Feinzerkleinerung zugeführt. Hierfür bietet sich die Ultra-Zentrifugalmühle ZM 200 an. Diese leistungsstarke Rotormühle ist einfach und sicher in der Bedienung und kann aufgrund der umfangreichen Zubehörpalette sehr vielseitig eingesetzt werden. So sind für die Aufbereitung der Haselnüsse zum Beispiel die Distanzsiebe besonders geeignet, die speziell für die Zerkleinerung temperaturempfindlicher spröder Proben entwickelt wurden. Da Mykotoxine gut fettlöslich sind, sollte die Vermahlung möglichst schonend erfolgen, um die Freisetzung von Fetten aus dem Probenmaterial zu vermeiden. Eine Feinheit von ca. 300 µm ist ausreichend für die nachfolgende Extraktion aus dem Probenmaterial.
Für die Extraktion werden 25 g der homogenisierten Nussprobe mit 200 ml Wasser/Acetonitril (16+84 v/v) 60 Minuten geschüttelt und filtriert. 100 ml des Filtrates werden mit Petrolether extrahiert; die Petroletherphase wird verworfen. Ein Aliquot wird mit Aktivkohle/Al2O3/Celite (7:5:3 – w/w/w) 10 Minuten gerührt, dann zentrifugiert, der Überstand eingedampft und in Wasser aufgenommen. Die Lösung wird auf eine Immunoaffinitätssäule aufgetragen, mit Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert und das Eluat dann mittels HPLC aufgetrennt.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen wie hohe Selektivität und Reproduzierbarkeit und sehr niedrige Nachweisgrenzen aus. Für die Probenvorbereitung stehen mit den Immunoaffinitäts(IA)-Säulen spezielle Festphasen-Extraktions(SPE)-Säulen zur Verfügung, bei denen die Aflatoxine an selektiv bindenden Antikörpern aus der Matrix isoliert und mit organischen Lösemitteln eluiert werden. Die erhaltenen Probenextrakte werden abschließend über eine RP18-HPLC-Phase separiert und die Mykotoxine mittels Fluoreszenz nach Nachsäulenderivatisierung, zumeist mit einer Brom- oder einer Jodlösung, detektiert. Häufig hängt die Freigabe von ganzen Schiffsladungen, davon ab, dass der Aflatoxingehalt in Nüssen schnell und exakt bestimmt werden kann. Die hier beschriebene Methode liefert repräsentative Ergebnisse in kurzer Zeit und gewährleistet somit sowohl für den Lieferanten als auch für den Verbraucher optimalen Schutz.
